Agora ambientado na cidade de Veneza, na Itália, dois séculos após o capítulo original, "Assassin's Creed II" centra-se na história de Ezio Auditore de Firenze, um jovem da nobreza italiana e o grande assassino da continuação. A nova aventura traz mais variedade - o ponto mais criticado no capítulo original - e utiliza vários pontos famosos da cidade das gôndolas como referência, entre eles o atelier de Da Vinci, a Basilica di San Marco e Ponte di Rialto.

Acompanhando a evolução, Ézio conta com habilidades e armas superiores às de Altair, como surpreender inimigos sem despertar suspeitas enquanto estiver camuflado na multidão - como acontecia entre os monges no original. Ézio porta duas lâminas ocultas - a principal arma usada por Altair - além de poder usar machados, maças, lanças e dois tipos diferentes de espadas.

Movimentos como escalar torres para ter a "visão da águia" - que funciona como um GPS para os pontos de interesse no mapa - e esconder-se no feno foram mantidos, acrescidos da possibilidade de nadar através dos canais venezianos.

Há 18 tipos diferentes de missões - entre os já conhecidos assassinatos, roubo de documentos e tocaias. Muitas envolvem as invenções de Da Vinci, como ilustrado em uma das imagens na qual Ézio sobrevoa Veneza utilizando as asas desenhadas pelo artista renascentista. A alternância entre dia e noite também adiciona novas possibilidades estratégicas às missões.

Itens escondidos, como as bandeiras do jogo original, retornam nesta continuação, mas agora compensam os jogadores mais dedicados a encontrá-los com benefícios dentro do próprio jogo, apesar da Ubisoft esconder tais benefícios a sete chaves.

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